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一、設(shè)計要求

根據(jù)《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》、《實(shí)驗室生物安全通用要求》、《生物安全實(shí)驗室建筑技術(shù)規(guī)范》等文件，為本方案設(shè)計依據(jù)。

1、概述

臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗又稱PCR實(shí)驗,是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法,測出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測岀的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點(diǎn),因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測部的禽疫病診斷。但是,這種實(shí)驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實(shí)驗室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來對臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室的建設(shè)越來越得到重視,因為它對檢測結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本設(shè)計方案主要從臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室的平面布局,空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制和污染的防制幾個方面對實(shí)驗室設(shè)計中的主要特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。因此,實(shí)驗室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進(jìn)行的。下面就對這幾個方面分別進(jìn)說明。

2、PCR實(shí)驗室平面布局臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室原則上分為四個單獨(dú)的工作區(qū)域:試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染,進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行,即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實(shí)驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。

3、實(shí)驗室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制PCR實(shí)驗室并沒有嚴(yán)格的凈化要求,但是為避免各個實(shí)驗區(qū)域間交叉污染的可能性,宜采用全送全排的氣流組織形式。同時,要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗區(qū)的壓力要求。

3.1試劑存和準(zhǔn)備區(qū)

該實(shí)驗區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū),不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi),并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制,本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。

3.2標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸DA提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定DA時DNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓,以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染,所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。

3.3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DA或CDA擴(kuò)增。此外,已制備的DNA模板和合成的CDA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行在巢式PCR測定中,通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管,因此巢式擴(kuò)増有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負(fù)壓,以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。

3.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測,此區(qū)域可不設(shè)。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源,因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負(fù)壓,以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。

4、污染的預(yù)防與控制

PCR實(shí)驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型:擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗就必須停止，直到找到污染源為止,而且實(shí)驗結(jié)果必須作廢,需重新進(jìn)行實(shí)驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣,浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染,首先應(yīng)是預(yù)防,而不是排除。

4.1工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分

(1)各個實(shí)驗區(qū)域設(shè)置合理

(2)各個實(shí)驗區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面鱖色等),以避免各個不同實(shí)驗區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

4.2合理的系統(tǒng)設(shè)置

(1)合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置,盡量釆用全送全排的空調(diào)系統(tǒng);

2)嚴(yán)格的氣流壓力控制,保證不同的實(shí)驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

4.3規(guī)范的操作

(1)臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn),經(jīng)培訓(xùn)冾格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗的工作

2)在實(shí)驗操作過程中,操作者必須戴手套,并經(jīng)常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施;

(3)清潔工作及時、正確。實(shí)驗工作結(jié)朿后,必須立即對本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進(jìn)行摽拭消毒或紫外線燈的照射消毒外,對一些實(shí)驗設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。

4.4嚴(yán)格的管理

(1)嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗室的人員。與實(shí)驗無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗室,有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個實(shí)驗區(qū)的門

(2)在各個實(shí)驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服(如不同顏色),當(dāng)工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域;

(3)盡量減少在實(shí)驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。

4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源,廢液不能在實(shí)驗室中傾倒,必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗室的地方棄掉,用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理,如焚燒等

5)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì),應(yīng)特別注意實(shí)驗人員的安全防護(hù)。